Test PCR

Maximilian Reindl a étudié la chimie et la biochimie au LMU de Munich et est membre de l'équipe éditoriale de depuis décembre 2020. Il se familiarisera pour vous avec les sujets médicaux, scientifiques et politiques de santé afin de les rendre compréhensibles et compréhensibles.

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Les tests PCR sont devenus un élément indispensable de la médecine moderne et du diagnostic moléculaire. Parce qu'ils sont si précis, ils sont considérés comme le "gold standard". Ils peuvent être utilisés dans un large éventail d'applications, de la détection d'agents pathogènes au dépistage de maladies héréditaires, c'est-à-dire partout où il est nécessaire de détecter de manière fiable même les plus petites traces de matériel héréditaire. Découvrez ici pourquoi le test PCR est si précis, où il est utilisé et comment il fonctionne en détail.

Qu'est-ce qu'un test PCR ?

Un test PCR est une méthode de laboratoire issue de la biologie moléculaire et de la médecine. Le test est utilisé pour la détection directe - et la caractérisation - du matériel génétique. La méthode PCR est considérée par les experts comme facile à mettre en œuvre, universellement applicable et robuste.

En laboratoire, un test PCR se compose de deux étapes. Dans un premier temps, le matériel génétique existant est reproduit à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase, ou PCR en abrégé. De cette façon, les plus petites traces d'ADN peuvent être examinées. C'est aussi la raison pour laquelle les tests PCR sont si sensibles.

Dans un deuxième temps, le matériel génétique est séparé, « trié » et ainsi caractérisé selon ses propriétés. Ainsi, la structure fine de l'ADN est déterminée.

Les utilisations possibles sont nombreuses : les médecins utilisent un test PCR pour examiner, par exemple, les frottis pour les coronavirus, les dons de sang pour le VIH ou dépister les nouveau-nés pour d'éventuelles maladies héréditaires. Les infections bactériennes - par exemple avec le pathogène de la tuberculose - ou les infections parasitaires (paludisme) peuvent également être clarifiées avec la PCR.

Ils aident également en médecine légale à condamner les contrevenants sur la base de leur empreinte génétique ou sont utilisés comme tests de paternité.

Toutes ces applications sont résumées sous le terme de diagnostic moléculaire. La PCR trouve ainsi une application pratique dans la recherche, le diagnostic et la médecine légale bien au-delà de la détection du pathogène Sars-CoV-2.

(Corona) test PCR versus test PCR rapide

Habituellement, l'évaluation d'un test PCR a lieu dans un laboratoire spécialisé. Cela signifie que l'échantillon de matériau y est envoyé et examiné. Le résultat est généralement reçu quelques jours plus tard.

Différentes startups (GNA Biosolutions, Spindiag) ont récemment présenté de nouveaux types d'appareils de test mobiles. Pour cela, ils ont également reçu des approbations spéciales de l'Institut fédéral des médicaments et des dispositifs médicaux (BfArM). Avec l'aide de ces appareils de test PCR mobiles, un test PCR serait également possible sans laboratoire spécialisé.

Cette approche a un grand potentiel, car un résultat de test fiable pourrait être disponible en quelques heures directement à l'endroit où l'échantillon a été prélevé (centre de test).

On ne peut pas encore évaluer dans quelle mesure ces systèmes de test PCR rapide prévaudront dans la pratique. On ne sait pas non plus à quelle vitesse les centres de test seront fournis avec ces appareils à tous les niveaux.

Dans un avenir prévisible, des tests PCR « réguliers » en laboratoire continueront donc à être effectués, ce qui entraîne un certain délai entre le prélèvement et le résultat du test.

Quelle est la fiabilité d'un test PCR ?

La PCR est une méthode de détection éprouvée en diagnostic moléculaire et en médecine. Il est considéré comme l'étalon-or avec un taux d'erreur très faible. Les tests se caractérisent notamment par une sensibilité et une spécificité très élevées.

La sensibilité signifie la fiabilité avec laquelle un test trouve le matériel génétique à détecter.

La spécificité signifie la certitude avec laquelle le test détermine que le matériel génétique en question n'est pas présent dans l'échantillon.

Quand les tests PCR fonctionnent-ils en cas d'infection Sars CoV-2 ?

En règle générale, le test PCR détecte une infection corona deux à trois jours avant et jusqu'à 20 jours après l'apparition des symptômes. Même avec des personnes infectées qui restent totalement asymptomatiques, le test fonctionne dans une fenêtre de temps critique lorsqu'elles peuvent infecter d'autres personnes.

Dans certains cas, la preuve est même possible 60 jours après l'apparition des symptômes de la maladie.

Le premier jour après une infection corona, un test PCR peut également être négatif, même si une infection est présente. Dans un tel cas, il n'y avait pas assez de virus dans la gorge au moment du frottis. Cependant, s'il existe une suspicion raisonnable d'infection, les médecins effectuent généralement un autre test PCR les jours suivants.

sources d'erreur possibles

Le taux d'erreur dans le processus de copie d'ADN est négligeable en pratique. Bien que les ADN polymérases ne fonctionnent jamais correctement, elles jouent à peine un rôle dans le processus de test PCR.

En pratique, les sources d'erreurs possibles résident dans le processus d'échantillonnage : il est donc important que du personnel médical formé réalise les frottis. Les échantillons de salive et de gargarisme pourraient éventuellement réduire la précision, car des effets de dilution se produisent ici.

Comment fonctionne un test PCR ?

Un test PCR est effectué, par exemple, par le médecin de famille ou dans des centres de test spéciaux. Tout d'abord, des médecins ou des professionnels de la santé formés prélèvent un échantillon. Habituellement, un écouvillon est prélevé des voies respiratoires supérieures pour le test. Cela prend généralement la forme d'un écouvillonnage de la bouche ou du nez et de la gorge.

Se gargariser avec une solution de rinçage est également possible. Un échantillon de sang est atypique pour une détection corona - mais répandu, par exemple, dans le dépistage néonatal.

Quel que soit le type d'échantillon prélevé, du matériel génétique se retrouve sur le coton-tige, dans la solution de rinçage ou dans une goutte de sang. Cet échantillon est envoyé à un laboratoire, où il est isolé et purifié.

Un test PCR est ensuite divisé en deux étapes :

• PCR : Dans cette étape, la quantité de matériel génétique d'origine est multipliée.
• Électrophorèse : Dans la deuxième étape, les segments du génome sont « triés » selon la taille. De cette façon, l'échantillon peut être caractérisé - la structure fine du matériel génétique est déterminée.

Étape 1 : PCR - "La réaction en chaîne par polymérase"

La "PCR" est la première des deux étapes de travail : Ici, la quantité d'ADN de départ existant est multipliée. Car ce n'est que lorsque le matériel génétique est disponible en quantité suffisante qu'il peut être examiné. Il s'agit principalement d'ADN humain ; les tests pour le coronavirus sont donc l'ARN du virus.

L'abréviation PCR signifie en anglais « Polymerase Chain Reaction ».

Que faut-il pour une PCR ?

L'ADN de départ se trouve dans un réacteur contenant des substances spéciales. Le matériel génétique existant sert de matrice, qui est copiée en présence de certaines enzymes (polymérase Taq) et de certains éléments constitutifs de l'ADN de base.

Le processus de copie se déroule en plusieurs exécutions - répétitives - (cycles).

Plus précisément, les substances suivantes sont combinées :

• ADN de départ : échantillon à répliquer.
• Éléments de base de l'ADN : Ce sont les nucléobases adénine, thymine, cytosine et guanine.
• ADN polymérase : Une enzyme qui relie des blocs de construction d'ADN individuels pour former un brin d'ADN bien défini. Le brin nouvellement obtenu est une image miroir (complémentaire) du matériau de départ d'origine.
• Solution tampon : La réaction en chaîne par polymérase a lieu dans une solution tampon physiologique. Cela garantit des conditions similaires à celles trouvées dans les cellules humaines. Cette solution maintient le pH stable et contient également des ions magnésium. Ces conditions contrôlées sont nécessaires pour assurer la fonctionnalité de l'ADN polymérase.
• Amorces : elles se composent de 16 à 24 paires de bases et servent de position de départ et de signal de départ. Les amorces montrent à l'ADN polymérase à quel point (de l'ADN de départ) le processus de copie commence.

Comment se déroule un test PCR ?

Étant donné que toutes les substances nécessaires à une PCR se trouvent maintenant dans le réacteur, le processus de copie proprement dit du matériel génétique peut commencer. Celui-ci n'est démarré, contrôlé et arrêté à nouveau que par la température.

Le récipient de réaction est par conséquent chauffé ou refroidi de manière ciblée à différentes températures. Cela se fait avec un appareil spécial - le soi-disant cycleur thermique. La réaction globale prend environ une à deux heures.

Les différentes étapes d'un cycle PCR sont :

• Dénaturation des doubles brins d'ADN : L'échantillon est chauffé à environ 90 degrés Celsius. En conséquence, le double brin d'ADN d'origine se brise en deux brins simples séparés (complémentaires).
• Fixation de l'apprêt : La température est abaissée à un peu moins de 60 degrés Celsius. En conséquence, les amorces (amorces directes, amorces inverses) se fixent à des positions définies sur les simples brins d'ADN correspondants.
• Extension : La température est augmentée à un peu plus de 70 degrés Celsius. L'ADN polymérase commence maintenant son travail à cet optimum de température. Il se fixe aux positions des amorces et étend progressivement le simple brin d'ADN original jusqu'à ce qu'une copie exacte (complémentaire) soit disponible (synthèse d'ADN).

Après un cycle terminé, la température est à nouveau augmentée à environ 90 degrés Celsius - le cycle recommence.

En utilisant la méthode PCR, les séquences d'ADN peuvent être répliquées jusqu'à environ trois kilo paires de bases (kpb). Cela correspond à environ 3 000 éléments de base de l'ADN liés pour former une « chaîne ». A titre de comparaison : le génome humain stocke les plans et les informations pour le fonctionnement de la cellule dans environ trois milliards de paires de bases - le génome du coronavirus, quant à lui, se compose de 30 000 paires de bases. Un test PCR ne peut être utilisé que pour reproduire et examiner de courtes sections de l'ADN total.

Les amorces sont cruciales

Le choix des amorces est critique pour le processus de PCR. Dans les diagnostics Sars-CoV-2, par exemple, plusieurs amorces sont utilisées (PCR multiplex).

Les tests PCR Corona recherchent trois gènes de virus différents : La spécificité globale augmente à près de 99,99%. Cela signifie qu'avec ce taux de réussite élevé, il n'y a qu'un seul test faussement positif pour 10 000 examens (si l'échantillon est prélevé correctement).

Combien de matériel génétique copié y a-t-il maintenant?

Supposons qu'après le premier cycle, il y ait deux doubles brins d'ADN identiques.

Après chaque cycle, la quantité de matériel génétique (copié) double. La quantité d'ADN croît donc de façon exponentielle.

En d'autres termes : après le deuxième cycle, il y a quatre doubles brins identiques - après le troisième cycle huit doubles brins - après le quatrième cycle 16 doubles brins et après le cinquième cycle déjà 32 doubles brins.

Les professionnels de la santé répètent généralement ce processus environ vingt à trente fois.

D'un point de vue métaphorique, cela signifie : Même si un seul double brin d'ADN a été trouvé dans l'échantillon au début, après vingt cycles, il y aura déjà un million de copies identiques dans le réacteur.

Que signifie la valeur Ct ?

Le nombre de cycles PCR terminés est donné sous la forme de la valeur dite Ct. « Ct » est dérivé du terme anglais « cycle threshold ». Cette valeur Ct permet de se prononcer sur la quantité de matériel génétique recherchée.

À une faible valeur Ct de 20, il y a beaucoup de matériel génétique de départ. Cependant, si la valeur Ct est élevée - environ 30 cycles - il y a en conséquence peu d'ADN. Le cycle PCR doit donc être exécuté plus souvent.

Etape 2 : Electrophorèse "Tri par taille"

Enfin, s'il existe suffisamment de matériel génétique « enrichi », ce que l'on appelle l'électrophorèse peut avoir lieu. Les scientifiques utilisent une certaine propriété de l'ADN : sa charge électrique.

Les différents éléments constitutifs de l'ADN sont liés les uns aux autres via un squelette sucre-phosphate chargé (négativement). Plus une certaine séquence d'ADN est longue, plus sa charge électrique est élevée.

Si le matériel génétique est placé dans un support spécifique (agarose) et qu'une tension électrique est appliquée, les segments d'ADN commencent à se déplacer en raison de leur charge. Étant donné qu'un tronçon d'ADN plus long se déplace plus rapidement qu'un fragment plus court, ils se séparent en fonction de leur taille.

De cette façon, le matériel génétique peut être examiné et caractérisé. En pratique, un échantillon inconnu avec une référence connue est généralement appliqué à une "ligne de départ" et comparé les uns aux autres après un certain laps de temps.

Si la "vitesse de migration" est la même pour les deux séquences, cela signifie : La détection est très probablement positive - le gène que vous recherchez est contenu dans l'échantillon.

Cas particulier du coronavirus : préparation des échantillons et RT-PCR

La détection d'agents pathogènes pour le coronavirus est un cas particulier.Sars-CoV-2 est l'un des virus dits à ARN. Cela signifie que le génome Sars-CoV-2 est sous forme d'ARN (acide ribonucléique).

L'ARN ne diffère de l'ADN que de quelques façons. Entre autres choses, il est disponible sous forme de simple brin et est basé sur le sucre ribose au lieu de 2 "deoxyribose. La nucléobase thymine a également été remplacée par l'uracile comme quatrième base.

Cet ARN viral doit être « transcrit » en ADN avant un test PCR régulier. Ce processus est appelé transcription inverse (RT) - d'où le terme RT-PCR. Au cours de ce processus, un seul brin d'ADNc (« ADN complémentaire ») est obtenu. Dans une étape supplémentaire, le brin d'ADNc unique est complété par un deuxième brin d'ADN inversé en miroir.

A la fin de la préparation de l'échantillon, il y a un double brin d'ADN qui correspond au plan d'origine de l'ARN du virus : seul ce double brin peut désormais être utilisé comme matrice dans un test PCR.

Combien de temps faut-il pour obtenir le résultat ?

Après avoir envoyé l'échantillon au laboratoire, vous recevrez généralement un résultat après un ou deux jours ouvrables.Dans les centres de test, qui examinent souvent les échantillons sur place, cela ne peut prendre que quelques heures. La période de temps dépend en grande partie du centre de test respectif et de sa logistique.

Malgré les processus de travail complexes, les laboratoires modernes sont capables d'effectuer des tests PCR à haut débit. Des dispositifs automatisés spéciaux aident à la mise en œuvre.

Le test PCR est toujours considéré comme une méthode de détection relativement « lente » mais d'autant plus fiable.

Que se passe-t-il si le résultat est positif ?

Si l'échantillon est prélevé correctement, un test PCR positif signifie que la personne testée est très susceptible d'être infectée par Sars-CoV-2.

S'il a été confirmé que vous êtes infecté par le coronavirus à l'aide d'un test PCR, le service de santé recevra un message du laboratoire respectif concernant le résultat positif du test. Dans un tel cas, le service de santé ordonnera l'isolement ou la quarantaine.

Suis-je automatiquement contagieux si j'obtiens un test PCR positif ?

La plupart du temps, oui. Mais pas toujours. Un résultat d'un test PCR doit toujours être interprété dans son contexte. Un test positif signifie principalement que vous avez du matériel viral en vous.

Si vous n'avez souffert que récemment du Covid 19 (quelques jours), un test PCR pourrait encore être positif - même si vous êtes déjà à nouveau en bonne santé. Il s'agit d'un cas particulier et de l'inconvénient d'un test très sensible, car il peut également détecter des fragments d'un virus qui ne peut pas se reproduire.

Un test d'anticorps supplémentaire est parfois utile

Dans de tels cas, un test d'anticorps fournit une certitude qui garantit la validité du test PCR. Il est préférable d'en discuter avec votre médecin. Ils peuvent vous aider à interpréter correctement un résultat de test PCR.

Que faire si le résultat est négatif

Un résultat de test PCR négatif signifie avec une forte probabilité que vous n'avez pas contracté le Covid-19 au moment du prélèvement et que vous n'êtes donc pas actuellement contagieux. Cependant, vous pourriez être aux premiers stades de l'infection.

Habituellement, les infections corona ne peuvent être détectées qu'à partir du deuxième ou du troisième jour après l'infection. Le résultat n'est donc pas un billet gratuit. Vous devez donc continuer à respecter les règles de distanciation et d'hygiène et continuer à porter un masque FFP2 - pour vous-même et pour la protection des autres.

Test PCR chez l'enfant

Un test PCR pédiatrique n'est pas différent d'un test PCR adulte. L'échantillonnage et l'interprétation des résultats s'appliquent à la fois aux enfants et aux adultes.

Quels sont les risques d'un test PCR ?

Un test PCR ne présente aucun risque physique. Seul le prélèvement par écouvillonnage nasopharyngé est perçu comme gênant ou désagréable par certaines personnes.

Combien coûte un test PCR ?

Tous les frais engagés pour un test PCR seront couverts si vos médecins traitants ou le service de santé approuvent un tel test. Le remboursement des frais est généralement envisagé si vous présentez déjà vos propres symptômes ou si vous avez été en contact direct avec des personnes infectées.

Même en cas de test rapide ou d'autotest positif, vous avez droit à un test PCR gratuit.

Attention : si vous vous êtes testé à domicile et que vous avez obtenu un résultat positif, vous devez immédiatement prendre rendez-vous avec votre médecin de famille par téléphone. Votre médecin traitant discutera avec vous de la suite de la procédure par téléphone.

Alternativement, il est préférable d'appeler le 116 117 pour vous inscrire à un test PCR. Jusqu'au test de confirmation, vous devriez idéalement rester chez vous pour vous protéger et protéger les autres.

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